Skip to content

分子系統解析

MEGAによる最尤法系統樹推定

MEGAは視覚的にわかりやすいGUI形式ですので,

特に解説は必要ないと思いますが,備忘録的に.



アライメントした配列を用意します.COI配列です.

Data→Phylogenetic Analysisを選択.



アミノ酸のコーディング領域かどうかを聞かれます.

今回はCOIなのでYesです.



うまくいけばこのようなウィンドウが表示されます.

MEGAの基本ウィンドウ(ここではMEGA 6.06(6140226))でPhylogeny→Construct/Test Maximum Likelihood Tree…を選択.



ここで解析のパラメーターを設定します.



Phylogeny Test :どのように系統を検定するかです.各枝の信頼性が得たい場合はここでBootstrap Methodを選択しましょう.

No. of Bootstrap Replications:Bootstrap検定を何回行うかです.100回でも構いませんが,1000回くらいはしたほうが無難です.2-3000回やってる論文もたまに見かけます.

Substitution Type:塩基(Nucleotide)かアミノ酸(Amino Acid)が選べます.選べないと困ります.

Model/Method:塩基(アミノ酸)置換モデルが選べます.

Rates among Sites:座位ごとの置換の頻度の違いを,ガンマ分布に基づいて分類するか否かを設定できます.

No of Discrete Gamma Categories:ガンマカテゴリ数を設定できます.

Gaps/Missing Data Treatment:ギャップの扱いの設定です.Complete deletionとすると,一つでもギャップがあるサイト(列)を解析からのぞけます.

ML Heuristic Method:最尤法系統樹の探索方法を選べます.系統樹探索方法についてはまたどこかで書くかもしれませんが,局所解がたくさんあるようなデータセットだと,ここでの方法選びは結構重要だと思います.いくつか試してみても良いかもしれません.

Initial Tree for ML:系統樹探索を行う際の,最初の出発点の系統樹の作成法を選びます.上記した通り,これも結構重要だと思います.デフォルトのNJでも問題はないと思いますが,もし既にそれらしい系統樹があるのであれば,それを設定する事もできます.

Blanch Swap Filter:系統樹探索の際の枝の入れ替えの大胆さを決めます.Strongにすると枝長の入れ替えがより消極的になり,解析時間は短くなりますが,考慮する系統樹は少なくなります.よりWeakにすると,枝長の入れ替えが大胆になり,解析時間は長くなりますが,考慮する系統樹が多くなるようです.



パラメーター設定が終わったら,Computeをクリックして解析開始です.

Progressが100%になるまで,気長に待ちましょう.



解析が終わると,このようにTree Explorerに系統樹が表示されます.

各枝の上にブートストラップ確率(2桁の整数)と枝の下に枝長(有理数)が示されています.



このExplorerで色々系統樹をいじれます.例えば特定の枝を選択して,左上のコマンドの中からPlace root on Branchを選ぶと



外群を指定できます.



他にもCompress/Expand Subtreeで,枝を一つにまとめたり,



Fit Tree to Screenで,ウィンドウ内に系統を収めたり,



Flip Subtreeで枝の上下を入れ替えたりできます.

良い時代になりました.



この他にもたくさんのコマンドがありますが,感覚的に理解できると思いますので,いろいろ試してみてください.



今日はここまで.


iqtreeによる最尤法系統樹推定

※もっと良いやり方をご存知の方はそっと教えてください.

iq treeは,パーティション分けが可能な最尤法系統樹推定ソフトです.

コマンドプロンプト対応で非常に使い勝手が良く,しかも解析速度がべらぼうに速いのが特徴です.

RAxMLがコマンドプロンプトに対応した今,やり方自体はRAxMLとほぼ同じです.
 

塩基配列データ作成(MEGA, SeaVeiwなど)
  • 事前準備として解析用フォルダをつくりましょう(iqとします).

アライメントソフトでの作業

  • アライメントを行ったセッションを.phy形式で出力する(iq.phyとしましょう).
  • パーティション分けとそれぞれのモデル指定のファイルを作る(iq.nexとしましょう).以下は例と解説(赤字)です.

#nexus

begin sets;

このコマンドで読み込みを開始します.

 

charset part1 = 1-430 431-1940\3 432-1940\3;

charset part2 = 433-1940\3;

charset part3 = 1941-2889;

ここで,モデルごとのパーティション分けを指定します.

ハイフンでつないだ配列が一つの領域で,それぞれをスペースで分けます.

アミノ酸指定領域の場合は,”日本円マーク”か”\”で各コドンをします.

ここでは,431番目から始まるアミノ酸指定の第一コドンと第二コドンは同じパーティションですが,

第三コドンは違うパーティションとしています.

 

charpartition mine = GTR+I+G:part1, TN93+I+G:part2, K2P+G: part3;

ここで,各パーティションごとのモデルを指定します.

よくモデルテストで見る形式をそのまま入力すればよいので楽です.

主な塩基置換モデルのリストはコチラ

 

end;

おしまい.


iqtreeを走らせる(コマンドプロンプト,iqtree)
  • 事前準備として,iqフォルダにiqtreeからDLしたiqtree.exeとiqtree-click.exeを入れておきます.

コマンドプロンプトでの作業

  • コマンドプロンプトを立ち上げ,iqフォルダまでのパスを通します.
  • iqtreeを走らせるためのコマンドを入力します.以下,例とコマンドの解説(赤字)です.

iqtree -s iq.phy -spp iq.nex -m TEST -bb 1000

“-s”で配列ファイルの読み込みを行います.

“-spp”でパーティション分けファイルの読み込み,

“-m” で検定方法を指定,

“-bb”でブートストラップ検定とその回数の指定を行います.


 

  • 解析が終わったら,iqフォルダ内に解析のログファイルや,系統樹ファイルiq.phy.treefileが生成されるはずです.
  • 参考までに,iqtreeでは他にも様々なコマンドがあります.コチラをご参照ください.

 

今日はここまで.


ArelquinによるAMOVA解析

※もっと良いやり方をご存知の方はそっと教えてください.

参考

http://hanzawalab.blog.fc2.com/blog-entry-43.html

http://nonomasu.blog.fc2.com/blog-entry-7.html

塩基配列データ作成(MEGA, DNAsP)

MEGAでの作業

  • MEGAでアライメントを行ったセッションをnexusファイルで出力する(Amo.nexusとしましょう).この段階で,AMOVA解析で扱う集団ごとにまとまるように配列の順番を入れ替えておくと後が楽.

DnaSPでの作業

  • 解析用のフォルダ(Amoとしましょう)を作り,その中にAmo.nexusを入れておく.

  • DnaSPを立ち上げ,File→Open Data FileでAmo.nexusを読み込む.
     

 

  • Data Informationが表示されれば,読み込み成功.Data InformationをCloseで閉じる.
     

 

  • Data→Formatでデータの形式を指定する.例えばミトコンドリアの16Sの場合は,DNA, Haploid, Mitochondorialにチェックを入れてOKをクリック.


 

  • Data→Define Sequence SetsでOTUのグループ分けを指定する.List of All Sequenesから,”>>”でIncluded  ListにOTUを移動し,Add new Sequence Setで名前を付ける.
  • 全てのグループに名前を付けたら,Update All Entries(赤文字になっているはず)をクリック.
  • Save/Export Data as…→Arlequin File Formatを選ぶ.
     

  • Not considered, Included,  Arlequin Haplotype Listにチェックが入っている事を確認し,OK.
  • .hapと.arpの二つを保存する.Amo.hap, Amo.arpとしましょう..hapは.arpのバッチファイル的なものらしく,必ずペアでAmoに保存しておく.
  • Amova解析の際には各集団を更に上位の集団にまとめる必要があるので,以下のテキストをAmo.arpの末尾に貼り付ける.赤字は任意に変えられる部分.

[[Structure]]

StructureName=”任意の名前
NbGroups=4

Group={
DnaSPで定義したグループ名1
}

Group={
DnaSPで定義したグループ名2
DnaSPで定義したグループ名3
}

Group={
DnaSPで定義したグループ名4

Group={
DnaSPで定義したグループ名5
DnaSPで定義したグループ名6
}


  • これでArlequin用の準備完了 .

※Arelquin上でもっと簡単にグループ設定する方法がありました↓

AMOVA解析(Arlequin)
  • Arelquinを起動し,”Open project”でAmo.arpを選択.左側の枠にSamplesやGroupsが表示されたらOK.

  • グループを設定する場合は,Structure Editorをクリックし,Population samplesの横のGroup(デフォルトでは0が表示されている)をダブルクリックし,任意のグループ名を入れると.右側の枠に階層構造として出力される.最後はUpdate ProjectをクリックすればOK.Projectタブでグループ分けが出来たかどうか確認できる.
  • “Settings”でAMOVAを選び,Standard AMOVA…をチェックし,プルダウンメニューの下の方で塩基置換モデルを選べる.普通はKimura 2Pが無難.
  • “Start”をクリックして解析.うまくいけば,Amo内にログなどが入ったAmo.resというフォルダが作成される.この中のAmo.xmlにAMOVA解析結果がHTML形式で保存されている.

更新:2017/3/11


MEGAによるモデルテスト

MEGAでは塩基(アミノ酸)置換の進化モデルテストを行うことができます.

進化モデルとは,解析するデータセットの中における,



①塩基(アミノ酸)の存在頻度

②塩基(アミノ酸)同士の置換確率



の組み合わせです.

最尤法では,節間の置換を計算するので,この進化モデルの選択は非常に重要です.



まずはアライメントした配列を用意します.今回はCOI領域の配列です.

Data→Phylogenetic Analysisを選択します.



タンパク質のコーディング領域かどうかを聞かれます.

今回はCOIなのでYesです.



このようなウィンドウが現れたらOKです.アライメントの中から,塩基置換が起きている部分だけを取り出したものです.

このPhylogenetic analysisモードは,MEGAで系統解析を行うための基本モードです.



Models→Find Best DNa/Protain Models (ML)を選びます.



この画面でモデルテストのセッティングができます.
 

Tree of use :テストの際に使う系統樹を指定できます.通常,デフォルトのNJ法でOKです.

Substitution type:Nucleotide(塩基)やAmino acid(アミノ酸)が選べます.

Gaps/Missing Data Treatment:ギャップやミッシングデータの取り扱いが選べます.Complete deletionで,ギャップが一つでもある列は解析殻除きます.Partial Deletionで,比較する配列ごとにギャップの扱いを決めます.Use all siteでギャップもミッシングデータも全て扱います.

Select Codon Positions:チェックを外したコドンを解析から除きます.コーディング領域の場合,特に3rdコドンが他とモデルが異なる場合があったりするので,きちんと全てのコドンについてのモデルテストを行っておくことをお薦めします.

Branch Swap Filter:系統樹の枝長に対する厳密性を決めるオプションのようです.複雑なモデルを使うと,色んな塩基置換パターンを考慮に入れられる反面,その分の解析上の煩雑さも増えてしまいます.この煩雑さを枝長と考え,各モデルごとに枝長と尤度を比較し,尤度の上昇と枝長の少なさのバランスが最も良いものをベストのモデルとして選ぶようです.この枝長は系統樹の探索によって決められていくのですが,その際に系統樹の一部の枝を入れ替えます.この時の入れ替えの「大胆さ」を決めるのがこのオプションのようです.従って,Strongにすると枝長の入れ替えがより消極的になり,解析時間は短くなりますが,考慮する系統樹は少なくなります.よりWeakにすると,枝長の入れ替えが大胆になり,解析時間は長くなりますが,考慮する系統樹が多くなるようです.ですので,時間に余裕があるときはよりWeakにするとよいでしょう.

※個人的な見解ですので,間違っていたら教えてください.
 

さて,長くなりましたが,セッティングを終えてComputeを選択するとモデルテストが始まります.



モデルを一つ一つ試しています.終わるまで気長に待ちましょう.



結果が出ました.注目すべきは,BIC, AICcです.これらの値が最も少ない(=尤度と煩雑さのバランスが最も良い)ものが,ベストなモデルとなります.

今回の解析では,GTR+G+Iがベストなモデルとして選択されました.他にも,f(A),f(T)…などはそのモデルの下での塩基の存在頻度で,r(AT)…などが置換確率となります.



このウィンドウの下の方に,それぞれのモデルに対する説明があります.

ここを参考にして,今後の最尤法解析などの際にパラメーターを設定します.



今日はここまで.


MEGAによるアライメント②

アミノ酸配列をコードしている領域の場合は,

DNA配列をアミノ酸配列に変換することで,

正しく配列が得られているか確認できます.
 

こちらは,アミノ酸をコードしているミトコンドリアのCOI領域

のDNA配列をアライメントしたものです.



ちなみに,このOTUの名前の付け方は長すぎる上に,

()とか系統解析状優しくない記号が使われている悪い例です.



各配列の一番上の行にアスタリスク(*)が示してある列は,

全てのOTUで塩基置換が同じ事を示しています.

従って,*が無い列はどこかのOTUで塩基置換が起きています.

この*を見ると,二列おきに無くなっている傾向が見られると思います.

これは,この配列がアミノ酸をコードするコドンは塩基3つで一組となっており,

その三番目が置換しやすい事を表しています.



左上の方のDNA Sequencesの横のTranslated Protein Sequencesのタブをクリックすると,



このようなウィンドウがポップアップするので,

Yesを選択するとDNA配列がアミノ酸配列に変換されます.

Noを選択すると,
 

このように,コドンがコードするアミノ酸の遺伝コードを選択する事ができます.

分類群に合わせて変更しましょう.



遺伝子コード表は,Data→Select Genetic Code Tableからも選択できます.
 

これが置換後のアミノ酸配列です.色付きの文字は全てアミノ酸です.

灰色の*は,ストップコドンでこれが見られる場合は,

アミノ酸変換が上手くいっていない事がほとんどです

(勿論,複数の遺伝子が発現するためのストップコドンの場合もあります).



というわけで,一番左の列を削除してもう一度アミノ酸変換してみました.

うーん,まだストップコドンがみられます.
 

更にもう一列削除してアミノ酸変換しました.

ストップコドンもみられず,配列も結構「揃って」います.

恐らく,これで正しくアミノ酸配列に変換できたものと思われます.
 

今日はここまで.


MEGAによるアライメント

MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis software)は,

アライメント,モデルテスト,系統解析までを一手にこなせる優れた系統解析ソフトウェアです.

昔はアライメントや簡単な系統解析が出来るくらいでしたが,現在はver. 7までアップデートを重ね,

モデルテスト,最尤法,祖先解析,分子分岐年代測定などが行えるようになっています.

また,開発者が日本人という事で,日本語でも扱えるため,大変有用なツールとなっています.

DLはこちら
 

備忘録的に,このMEGAの使い方を記録していきます.

MEGAをインストールしたら,MEGAのアイコンをダブルクリックすると,以下のウィンドウが起動します.
 

これがMEGAの基本画面です.
 

まずアライメントです.”Align”→”Edit/Built Alignment”を選択.
 

Creat a new alignmentをチェックし,OKをクリックすると,以下のようなExplorerが起動します.
 

“Edit”→”Insert Sequence From File”を選択します.
 

DNA(もしくはアミノ酸)配列のファイルをPCから読み込みます.読み込める形式は色々ありますが,

このように,メモ帳に直接塩基配列をペーストしただけのものでもOKです.
 

配列が読み込めました.色が付いている部分が塩基配列です.A, T, G, Cでそれぞれ色分けされています.
 

“Alignment”から,”Clustal W”と”Muscle”の二つのアライメント方式が選べます.

今回はClustal Wを選択してみます.
 

ここでは,アライメントのパラメータの設定ができます.

Gap Opening PenaltyやGap Extension Penaltyの値を高く設定すれば,なるべくギャップが少なく,連続しないアライメントになります.

DNA Weight Matrixでは,塩基とアミノ酸の置換に対するスコアを選択できます.

Transition Weightで,転位と転換の差を設定できます.

他にも,Keep Predefined Gapsでギャップを完全に無視したアライメントや,

Specify Guide Treeで,アライメントの指標となる系統樹を指定できるようです.
 

もしデフォルトのセッティングでアライメントが上手くいかない場合は,この値などをいじってみましょう.
 

とりあえずデフォルトの設定でOKを押すと,アライメントが始まります.
 

アライメントができました.うまく揃っている部分と,ごちゃごちゃになっている部分があります.

これはリボソームRNAの配列なので,立体構造をとったときの活性部位と不活性部位です.

ごちゃごちゃの部分はギャップが多いエリアを除いてしまうか,

立体構造を考慮して系統解析を行います.
 

今日はここまで.


RAxMLによる最尤法系統樹推定

※もっと良いやり方をご存知の方はそっと教えてください.

塩基配列データ作成(MEGA, SeaView)

MEGAでの作業

  • MEGAでアライメントを行ったセッションを出力する.配列の結合を行う場合は,その後SeaViewで読み込むので,”.nexus” or “.nex”でも”.fasta” or “.fas”とかでもOK.行わない場合は”.phylip or “.phy”で出力.
  • ↑のファイルのOTU名は,それぞれのファイルで同じにしておく(”Ophi281_COI”とか”Ophi281_16S”じゃダメ).また,配列内のギャップ(”-“で指定する事が多い)と混同する事が多いため,OTU名には”-“は使わないほうがいい.

SeaViewでの作業(配列を結合する場合)

  • FileタブのOpen ***(***はファイルのフォーマット)を選び,結合させたい配列その1を選ぶ.
  • 同じようにその2,その3を選ぶ.それぞれ別ウィンドウで表示されればOKだが,不安な場合はFileタブのNew windowを選び,新しいウィンドウで配列を読み込めばOK.
  • FileタブのConcatenateを選ぶと,結合先の配列選ぶウィンドウが表示されるので,結合したい配列を選ぶ.by nameを選び,”OK”をクリック.
  • 上手くいけば,各OTUの後に配列が付加される.
  • これで準備完了.最終的な結合配列をFileタブのSave asからphylip形式で保存する(RA.phyとしましょう).
最尤法系統樹作成(RAxML)
  • 解析用の適当なフォルダ(RAとしましょう)を作り,その中にRA.phyを入れておく.
  • RA内にパーティション分け用のファイルを作っておく.例えば1-300 bpまでが16S, 301-1200までがCOIの場合は,以下のようなテキストデータファイルを作ります(partition.txtとしましょう).

DNA, 16S=1-300
DNA, COI=301-1200


  • RA内に”raxmlHPC.exe”を入れておく.これがRAxMLの起動ファイルです.これで準備完了.
  • コマンドプロンプトを起動(ウィンドウズメニューから探すか,ファイル検索で”cmd.exe”を検索)し,”cd 「RAのアドレス」”を入力してRA内に移動します.「RAのアドレス」はフォルダのアドレスバーの部分を左クリックすると”C:\Users\****\Desktop\研究\分子系統解析\RA”みたいなのが選択できるので,コピーしてコマンドプロンプト内で右クリックするとペーストできます.
  • “>”の後ろにRAxMLの起動コマンドを入力します.このコマンドは色々あるのですが,例えば

raxmlHPC -f a -m GTRGAMMA -p 12345 -x 12345 -# 1000 -s RA.phy -q partition.txt -n out

  • と入力すれば解析が始まり,GTRGAMMAモデルでブートストラップ1000回行った最尤法系統樹が得られます.
  • このコマンドなどについては井上潤さんのページにすごく詳しいです.
  • 出力されたファイルのうち,”RAxML_bipartitions.out”が系統樹のファイルです.TreeViewやFigtreeなどで閲覧して見てみましょう.

更新:2017年3月5日


ハプロタイプネットワーク構築

※もっと良いやり方をご存知の方はそっと教えてください.

塩基配列データ作成(MEGA, DnaSP)

MEGAでの作業

  • MEGAでアライメントを行ったセッションを,”.nexus”で出力する.

DnaSPでの作業

  • 出力したファイルをDnaSPで読み込む(File→Open Data File).
  • Data Informationウィンドウが表示されたら読み込み完了.Closeでウィンドウを閉じる.この時,Nは読み込むが,その他の記号(YとかWとか)は読み込まないようなので,おとなしくNに変換するか,その配列もしくはOTUは削除する.
  • Generate→Haplotype Data Fileで,Haplotype/DNA… ウィンドウを表示させる.GenerateのRoehl Data File (Network software)をチェックし,.rdfファイルを出力する.
  • この時Output of:… というウィンドウが表示されるが,これはハプロタイプとOTU名の対応が書かれた重要なデータなので,メモ帳にコピペなどをしておく(Haplotype/DNA… ウィンドウでNEXUS Haplotype Data Fileにチェックを入れば,.nexとして出力できる).
ハプロタイプネットワーク作成(Network)

Network での作業

  • Data Entry→Import rdf fileで,.rdfファイルを読み込む.
  • File selection ウィンドウでDNA Nucleotide dataがチェックされている事を確認し,Continueをクリック→.rdfファイルを開く.
  • RDF-Editorウィンドウで各種設定を確認・変更可能.設定が終わったらSaveをクリックし,元の.rdfファイルを上書き,あるいは別名で保存.
  • RDF-EditorウィンドウをExitで閉じ,Calculate Network→Network Calculations→Median JoiningでMedian Joiningウィンドウが開く.
  • Median JoiningウィンドウでFile→Openで.rdfファイルを再び開く.
  • Median JoiningウィンドウでCalculate networkをクリックすると計算が開始され,.outファイルが出力される.
  • メインウィンドウのDraw networkでDraw Networkウィンドウを表示させ,File→Openで/outファイルを開く.
  • OK→Yes→Continue→Finaliseでハプロタイプネットワークが完成.各ハプロタイプを右クリックすると,円グラフの組成がいじれる.

 

更新:2017年3月4日


海産無脊椎動物分子系統学実習⑫

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

打ち上げ翌日は最終日,いよいよ成果発表です!

トップバッターはコガモガイ類の分子系統.

様々な基質に付着する個体を解析し,

基質と系統との違いを考えてもらいました.
 

いくつか,本州にいるとは考えにくい種の配列が読まれており,

果たして種の新分布域の発見なのか,

それとも解析上のハンドリングミスなのか,

色々な意見が飛び交いました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

お次はプランクトンの発表.

今回はヤムシ,プルテウス,ネクトキータ幼生の解析に成功し,

それらとウェブ上のデータを比較して,種を推定してもらいました.
 

興味深かったのが,オフィオプルテウスが,

高確率でOphiura ooplaxの幼生である事が判明したことです.
 

本種は東シナ海から太平洋海域に生息しているのですが,概して深海性であるため,

今回の結果は,深海種の幼生が,田辺湾の入り口まで流れ着いていることを示唆します.
 

分子系統解析がの種の同定ツールとしての有用性を示していますが,

一方で,今回は一個体をまるまる解析に用いてしまったので,

証拠標本が残らないなどの問題点も指摘されました.
 

今後も内容の改変が必要かもしれません.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ナガウニ類の発表.唯一,実習の第一期から残っているテーマです.

これまでのデータも併せて,段々とナガウニ類の分類が見えてきました.

今年はOBの座安さんから得たリュウキュウナガウニのサンプルのデータも加えられたことで,

更に有意義な考察ができたようです!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

そしてウミグモの発表.

今回,最も成功データが少なくなってしまった分類群です.

特に,同種であるにも関わらず採集場所ごとに結果が違ってしまったので,

ひょっとすると固定方法に何か問題があったかもしれないとの結論が得られました.

宮崎先生も見守る中,堂々と発表をしてくれました!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

最後はケフサイソガニとタカノケフサイソガニの発表.

この班は解析個体の形態観察から,

ウェブ上のデータの検討までかなり精密に行っていて,

二種を分けた論文(Asakura & Watanabe, 2005)の結果を支持するものとなりました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

興味深い結果に,たくさんの質問が飛び交い,盛り上がりました!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ということで,海産無脊椎動物分子系統学実習のカリキュラムが無事終了しました!

中野先生からの総括の後,参加者の皆さんに一言ずついただきました.

最後に,カリキュラムを終えた参加者の一回り大きくなった姿をご覧ください.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



OLYMPUS DIGITAL CAMERA



分子系統学への興味,自身の卒研のため,

研究のため...
 

思いは様々ですが,それぞれに得たものの大きさを語ってくださいました.

また,この実習でリベンジを誓った参加者もいるようです.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

最後に朝倉先生のお話で締めです.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

記念撮影のあと...
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

最後は恒例のウミウシフィギュアの配布です.
 

お疲れ様でした!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑩

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

いよいよシーケンスデータが返ってきました.

これからデータの解析に移ります.

 ということで,これから描いてもらう系統樹の基本的な読み方の講義のあと...
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

まずは解析対象種の近縁種をデータバンクから集めてもらいます.

FASTAファイルの作り方など,解析データの基礎を説明.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

各自のPCでアライメントから系統樹の作成を行ってもらいます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

帰ってきたシーケンスデータのアセンブルです.

なかなかの成功率だったようです!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

自分たちのデータと,データバンクのデータを合わせ,いよいよ本格的に解析開始!

得られた系統樹が何を意味するかは,

その系統樹に使われたデータの元の文献情報に当たらなければならないときもあります.

系統解析は,系統樹を書いてからが本番なのです.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ケフサイソガニチームは,スペシャリストの朝倉所長にお話しを伺っていました.

記載されたご本人がいらっしゃるとは,大変に恵まれた環境と言えるでしょう.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

翌日の発表の備え,みんなでお掃除.

長きにわたり,お疲れ様でした!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑨

 

サンプル収集の次は座学です!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

今回実習生として参加してもらった山室教授にお話してもらいました.

「ラグーンから考える生態系の保全」
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

山室先生は地学出身で保全生態関連のお仕事に携わっておられます.

様々な手法を用いて多角的に水域環境動態を研究されています.
 

環境学に用いられる分子系統学的手法の解釈を学ぶため,

今回の実習に参加されたそうです.
 

いつまでも新しい手法を学んでいく姿勢がとても素敵ですね.

ご自身の発表にそれがよく表れており,

かくあるべきと身が引き締まる思いでした.

刺激になります.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

宮崎先生の「カイヤドリウミグモの分類をめぐるいくつかの謎」
 

今回の実習の対象の一つ,カイヤドリウミグモについてのお話です.

ウミグモ担当の実習生は絶対に逃せません.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

久保田先生による「不死のベニクラゲと早死のカイヤドリヒドラクラゲの分子系統形態の関連」
 

スライドは使わず,プリントを見ながらのお話です.

太平洋に広く分布するベニクラゲの仲間の分子系統解析の結果,

隠蔽種の存在が示唆されているそうです.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

大和先生の「ヨコエビ類とフジツボ類における種」
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

大和先生は,ヨコエビやフジツボを研究対象として,

「種」の問題に関する考察を行っておられます.
 

今日までずっと議論が続いている非常に難解な問題について,

分類の問題を絡めつつ,綺麗にまとめてくださいました.
 

今回の実習では分子系統樹から種の分類を考察してもらいますが,

実はそれは分子系統樹一本だけから簡単に導けるものではありません.
 

「種とは何か?」という大命題に関するお話は,

私自身にとっても勉強になりました.


海産無脊椎動物分子系統学実習⑧

磯で採集した生物の同定です!

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ケフサイソガニの同定.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

宮崎先生による,フタツメイソウミグモのご説明.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ウミグモ担当の学生さんと,濃密なディスカッション中.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ウニ担当の学生さんは,凝って写真を撮影しています.

ユニパックに分けている姿がプロっぽい!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

他にもアカクラゲや,
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

M1の中町君の研究対象のシリケンウミセミも採れた模様です.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

もう実験はないので,使った器具を綺麗にエタノールで掃除.

お次はいよいよ解析です!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑦

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

DNAデータの解析には線用のソフトウェアが必要不可欠.

最近ではアライメント,モデルテスト,系統解析を一手に担ってくれる優れたソフトウェアが開発されています.

これらをインストールするため,

河村博士がネットアクセスの方法を丁寧に説明します.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

順番が逆になりますが,シーケンス解析の外注の待ち時間で,

今回の実習で扱った生物の採集のため,磯に赴きます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

カサガイ類の説明.何気なく転がっているように見える岩にも多様な生物が張り付いています.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

近くの岩礁でフタツメイソウミグモの採集.

何故かこのあたりの岩の下にだけ,常に本種の集団が見られます .
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ナガウニの採集.本当はもっと番所崎の先の方へ行けば複数種のナガウニがみられるのですが,

天候の関係で近くのタイドプールにとどまりました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

干潟河口に移動し,ケフサイソガニの採集.

皆で石をはぐってやると,それなりの数が採れました!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

採集の後は講義「深海生物テヅルモヅルの謎を追う」
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

テヅルモヅルやクモヒトデ,および自身の研究の紹介を行わせていただきました.

ステキな写真を撮ってくださった河村博士に感謝です!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑥

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

PCRの結果確認のための電気泳動です!

まずは1%濃度に調整したTAE溶液とゲル粉末を混ぜ合わせ,
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

レンジで溶かします!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

いい感じに溶けたかな?
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

分子の先輩の凌君に確認中.

(熱された溶液にはくれぐれもご注意を!)
 
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

溶液に適量のミドリグリーン(DNA蛍光試薬)を混ぜ,トレイに流し込みます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

電気泳動層にゲルを淹れ,PCR産物と色素を混ぜ,ゲルの穴に流し込みます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

20分後,十分に流れたバンドを確認!さあうまくいってるかな!?
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

いよいよLEDでバンドの有無を見ます.

結果はまずまず!全ての対象生物でバンドが見えていました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

PCRが成功したDNA産物を,限外濾過法により精製し,余計な配列やdNTPを取り除きます!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑤

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

切り出した組織にタンパク質溶解酵素を加え,
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ブロックインキュベーターで温めること1時間.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

DNA変性させ,フィルターのグラスファイバーに吸着できる状態にします.

この作業によってDNA以外の組織が洗い流されます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

M2の凌君です.

この一年間で分子系統解析のテクニックを付けて,

頼れるTAとして活躍してくれました!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

サンプルを遠心しフィルターを通します.

それぞれのサンプルの数を計算しないと対象に配置できないため,

慎重に作業が進められます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

合間にチップを詰め替えてくれる凌君!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

抽出したDNAテンプレートを使って,いざPCRです!

手前の発泡スチロールに氷を入れて,氷上で作業をします.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

試薬を混ぜ合わせたら,いよいよPCRです.

サーマルサイクラ―にセットして数時間放置!



OLYMPUS DIGITAL CAMERA

夜は担当の中野先生のお話「カサガイの生物学」で締めです.
 

ここまでくれば折り返しです!


海産無脊椎動物分子系統学実習④

分子実習レポです.

今回は5つのテーマが用意されました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

①カメノテ,フジツボなど様々な基質に付着したコガモガイ.

付着基質の違いと系統の相関を見ます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

慎重に軟体部だけを殻から取り除きます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

とれましたね!後は足の部分を切り取り,DNA抽出に使います.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

体の残った部分は,証拠標本として残します.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

②お次はプランクトン.事前に河村博士が仕分けてくださいました.

様々な動物群から一種選び,その系統的な位置や,

親の同定を試みます.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

③事前に内之浦で採集したタカノケフサイソガニとケフサイソガニです.

形態的に非常によく似た二種のDNA配列を比較します.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

河村博士による分類法の講義.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

こちらは足の筋肉からDNAを抽出です!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

④お次はおなじみのナガウニです.

日本に生息していると言われる4種のナガウニのDNA配列を調べます.

今回は,これまで手に入らなかった南方性のリュウキュウナガウニが手に入りました!

瀬戸OG(現:OIST)の座安さんが採集してくださいました.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

解剖し,体の中にある管足の根元(瓶嚢)の列を取り出します.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

⑤カイヤドリウミグモ

カイヤドリウミグモの系統的な位置を確かめると共に,

産地による遺伝的な違いを検証します.


海産無脊椎動物分子系統学実習③

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

分子実習レポートです.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

まずは対象とする生物の選択です.

余りに小さいウミグモに目を凝らしたり...
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

中山君の対象のコガモガイの説明を受けたり.
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

生物のあとは,白衣装着!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ゴム手袋装着!
 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

ピペットマンやチューブ使い方など,基礎をみっちり学んでもらいました!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑩

長きに渡る分子系統実習のレポートも、いよいよ最後です!

IMG_1308

ついにシーケンスの結果が返ってきました。

解析用PCで慎重にデータを整理します。

IMG_1327

データ解析中。

四苦八苦しながら自分で系統樹を構築していきます。

一番ドキドキする瞬間ですね!

IMG_1361

キレイにアライメント(塩基配列の整列)ができました!

実はなにげに時間のかかる作業です。

IMG_1354

 系統樹ができあがりました!

さて、この系統樹にはどんな意味があるかな?

系統学や生物地理学は、分子系統解析の登場以後、大きく変わってきました。

 しかし、分子系統学的手法は、あくまでもツールの一つにすぎません。

得られた系統樹やハプロタイプネットワークの意味するところは、

解析対象とした生物の分類や生態に秘められています。

DNAだけをみて、

生物そのものの観察を怠っては、結局は何も得られません。

今回の実習では、そのようなことも

学んでもらえる良い機会だったのではないでしょうか。

IMG_7837

 真面目な話はそれくらいにしておいて、

打ち上げ開始ッ!

IMG_7860

乾杯!

…の前に、隣の学生がぼそっと一言

「今日から、お酒が飲めるんだ…」

なんとこの日が誕生日だったそうです!

早く言えばケーキも買ってきたのに!笑

IMG_7865

瀬戸実習名物教員お手製料理①

宮﨑先生お手製の「アサリのパスタ」

IMG_7838

その②

中野先生お手製の海鮮味噌汁。

美味しい料理と美酒に酔いしれ、

実習最後の夜は更けていきましたとさ。



というわけで、長きに渡った分子実習レポートですが、

これにて終了!

3月はまだまだ実習ラッシュだったので、今後、少しずつアップしていきます!


海産無脊椎動物分子系統学実習⑨

座学もたくさん行われましたよ!

私も講義を行いました。

IMG_1080

「テヅルモヅルの分子系統」

私の専門のテヅルモヅルの分子系統解析と、

ちょこっと腕の分岐の進化についての話をしました。

IMG_1265

宮崎先生のお話

「コスモポリタン種(?)フタツメイソウミグモの系統、分類、進化に関する話題」

今回の実習の研究対象であり、

今年卒業したもっちーが専門にしていたフタツメイソウミグモについて、

愛弟子の研究成果も踏まえて熱く語ってくださいました。

IMG_1246

久保田先生はベニクラゲについて語ってくださいました。

「不死のベニクラゲと早死のカイヤドリヒドラクラゲの分子系統と形態の関連」

あまり知らなかったのですが、ベニクラゲの遺伝子情報ってそれなりに蓄積されているんですね。

ウェブ上の情報だけでも面白い系統樹がかけたそうですよ。

IMG_1211

朝倉先生の話題

「海洋生物にとって種とは何か?」

種概念という、生物学の根幹にありながら、

未だに解決されれていない大問題について、

問題提起も含めつつわかりやすく解説してくださいました。

IMG_1306

大和先生の「田辺湾の動物相の変遷」

田辺湾は瀬戸臨海実験所でも創立からずっと調査されていて、

長期間にわたる調査データが蓄積されています。

この田辺湾の研究の歴史や、環境の変化と生物相の変遷の歴史についてをお話いただきました。

IMG_7823

この日は座学づくしでしたが、実習生たちは真面目に取り組んでくれましたので、

ご褒美(?)の温泉です!

しっかり疲れを癒して、明日もまた頑張りましょう!


海産無脊椎動物分子系統学実習③

実習二日目。

基礎技術を習得し、いよいよ実習開始です!

 

IMG_0265

まずはサンプル選び。

今回の実習ではウミグモ、ナガウニ、イボニシ、ベッコウガサを解析対象にしました。

 

IMG_0271

M2のもっちーが修論で集めたフタツメイソウミグモのサンプル。

どうも伊豆と下田のに地域と、寄生・自由生活性の生態型があります。

果たしてこれらは別種なのか?

 

IMG_0296

元帥の教えを受けつつ、いよいよ実験開始です。

 

IMG_0309

大きめのナガウニは、取り出すのにも一苦労。

 

IMG_0318

例によって、メガネを装着してのウニの解剖です。

 

IMG_0411

元帥の的確な指導を受けて、学生たちの実力がメキメキとアップしていきます!

取り出した生物の組織を、タンパク質融解酵素と混ぜている所です。

 

IMG_0384

成長の喜びがよく表れていますね~。

 

IMG_0393

分子実習秘密機器その一、「ヒートブロック」

これがなくてはタンパク質融解やヒートショックは始りません。

 

IMG_0359

1.5 mlチューブをセット!

 

IMG_0337

次はDNAの抽出とPCRです。

皆さん、大分分子機器の扱いに慣れてきたようです。

 

IMG_0395

分子実習秘密機器その二、「サーマルサイクラー」

この箱の中は、温度が一定のサイクルで変わるようになっています。

これで様々な設定条件の温度を繰り返すことによって、人工的にDNA複製を行うのです。

 

IMG_0416

 

サーマルサイクラーにチューブをセットして、今日の実習はおしまい!

明日はいよいよPCRの結果がわかりますよ!

 

続く


海産無脊椎動物分子系統学実習②

夕食後は器機の使用法の説明です。

IMG_0155

IMG_0242

まずは分子実験の基本装備である白衣のサイズ合わせです。

全員に合う分のサイズがあって一安心。

IMG_0192

ピペットマン(数μlの試薬を、極小のチューブ内に出し入れできる器具)を制する者は実験を制します!

基礎をじっくり教え込む中野元帥。

IMG_0204

水を使って練習。

ピペットマンの使用法を体に刻み込みます。

IMG_0238

次は「タッピング」の習得です。

チューブを指ではじくことで中の試薬を混ぜるテクニックです。

IMG_0212

 

実習は夜遅くまで続きました。

翌日は、いよいよ朝から実験開始です!


海産無脊椎動物分子系統学実習①

今年も分子系統学実習が始まりました!

IMG_0059

分子系統学を修めるべく、中野分子系統元帥のもとに五人の戦士たちが集まりました!

IMG_0063

まずは所長の朝倉先生のご挨拶。

IMG_0067

研究員もご挨拶。

IMG_0080

そして学生の挨拶。

クラゲ好き、ナマコ好き、カニ好きなど、

今年もユニークな学生が集まりました!

IMG_0085

その後、元帥による実習所の案内。

IMG_0099

廊下も案内。

ここには所員の研究成果を張り出してあるのです。

IMG_0117

研究員の河村さんのクラゲ飼育水槽公開!

左にタコクラゲのポリプ、右にベニクラゲのポリプが飼われているそうですよ!

IMG_0129

図書室をご案内。

実は本書には昔の海外の航海記(Siboga Expeditionなど)

などの貴重な図書が収められており、

今でも複写のために多くの研究者が訪れています。

IMG_0134

その後、朝倉先生の講義です。

分子系統解析を学ぶ上で欠かすことの出来ない、

分類学や種の概念についての基礎についての内容です。

IMG_0143

皆熱心に聞いていました。

翌日からは、いよいよ分子実習本番です!